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【買試劑,找華雅】mRNA轉(zhuǎn)染IVT攻略:流程及試劑推薦

更新時間:2025-01-15 點擊次數(shù):488

mRNA轉(zhuǎn)染的優(yōu)勢

與DNA相比,mRNA轉(zhuǎn)染具有以下優(yōu)勢:
  1. 高效且可控的表達:mRNA能迅速翻譯為蛋白質(zhì),表達短暫且可控,降低過度表達風險。
  2. 細胞友好:mRNA引入細胞內(nèi)不易造成損傷。
  3. 安全性與低免疫原性:mRNA不整合入宿主基因組,降低基因突變風險,降解產(chǎn)物為細胞自然成分。
  4. 快速響應與靈活性:mRNA快速合成能力使科學家能迅速調(diào)整實驗方案。

IVT的主要步驟

模板制備

  • 以質(zhì)粒DNA為起點,通過瓊脂糖電泳鑒定質(zhì)粒。
  • 選擇超螺旋狀態(tài)最佳的菌株,進行線性化質(zhì)粒,選擇合適的限制性內(nèi)切酶(如BsaI)進行切割。

酶法加帽

  • IVT后,使用牛痘病毒加帽酶和mRNA 2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶為mRNA加帽,增強穩(wěn)定性。

轉(zhuǎn)錄反應

  • 準備線性化質(zhì)粒模板,加入轉(zhuǎn)錄緩沖液、NTPs和RNA聚合酶,在37°C孵育合成大量mRNA。

純化

  • 采用柱純化、磁珠純化或酚/氯仿純化等方法,去除雜質(zhì),提取純凈的mRNA。

定量與檢測

  • 使用紫外吸收法、染料法或毛細管電泳法對mRNA進行定量和純度檢測。

共轉(zhuǎn)錄法加帽

  • 為提高效率,可在IVT過程中直接加入帽子類似物,實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄與加帽同步進行。

 IVT的主要試劑

目前市場上有多種成熟的商品化IVT試劑盒,如Thermo Fisher、NEB、諾唯贊、江蘇申基等,均提供完善的解決方案。

轉(zhuǎn)染試劑選擇

ProteanFect

  • 首·款基于蛋白遞送的轉(zhuǎn)染試劑,非常適合mRNA轉(zhuǎn)染。
  • 在多種難轉(zhuǎn)染細胞系中效率顯著優(yōu)于lipofectamine。

ProteanFect在難轉(zhuǎn)細胞中的應用

  • 在Jurkat T細胞中,ProteanFect展現(xiàn)出對多種類型核酸的高效遞送能力。


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