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淺談胰酶的配制方法

更新時間:2014-10-29 點擊次數(shù):3047
胰酶的配制方法
  Hanks液是常見的平衡鹽溶液(BSS)之一。D-Hanks液則是無鈣鎂離子的Hanks液。BSS與細胞生長狀態(tài)下的pH值、滲透壓及無菌狀態(tài)一致,且配方簡單,是組織培養(yǎng)基本用液,常用于配制培養(yǎng)基及其他用液,或洗細胞等,細胞在BSS中可生存幾個小時。 胰蛋白酶(胰酸)溶液是一種常用的細胞消化液,原代培養(yǎng)時用于處理組織塊,使細胞分離下來。傳代時用胰蛋白酶使培養(yǎng)細胞離開所貼附的培養(yǎng)瓶表面,并分散成單個細胞。胰蛋白酶主要采自牛或豬的胰臟,呈白色粉末狀,易潮解,應(yīng)在低溫干燥處保存。胰酶的活力常用一份胰酶解離酪蛋白的份數(shù)表示,常用胰酶活力為1:125或1:250。一般來說濃度大、溫度高(勿高于37℃)、作用時間長,則對細胞分離能力大。但超過一定程度會損傷細胞,導(dǎo)致細胞傳代后不能貼壁或死亡。胰酶在pH 8.0、37℃時消化能力zui強。溶液中的Ca2+、Mg2+和血清會降低胰酶活力,所以配制胰酶時須用無Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。當消化結(jié)束時,可加入少量血清或含血清的培養(yǎng)基以終止胰酶作用。 細胞傳代使用的胰酶濃度是0.25%或0.2%。用于原代細胞培養(yǎng)消化組織塊則為0.1%或0.125%。
(一)配制D-Hanks液
1.按表2—3—5稱取D-Hanks試劑。
2.依次加入上述試劑至800 mL蒸餾水中,溶解后定容至1 1000 mL。 3.高壓滅菌,10磅10 min。
(二)配制Hanks液
1.按表2—3—5稱取Hanks試劑。
2.配制Hanks時,需將CaCl2另溶解于100 mL的蒸餾水中。
3.依次加入上述試劑至700 mL蒸溜水中,溶解后再與CaCl2溶液一起定容至1 000 mL。
4.10磅,10 min高壓滅菌。
(三)配制胰蛋白酶消化液
1.D.Hanks液高壓滅菌之后,晾至室溫,4℃保存?zhèn)溆谩?/div>
2.稱取一定量胰蛋白酶粉末于研磨器中(夏天時研磨器應(yīng)放在冰浴中),加入少量D-Hanks液研磨1 000次左右,調(diào)制成糊狀。再放入4℃預(yù)冷的適量D-Hanks液中,4℃下磁力攪拌使*溶解。
3.用NaHC03干粉將胰酶溶液的pH值調(diào)至8.0左右(胰酶作用的zui適pH值),并加入0.02%EDTA以協(xié)助消化作用。
4.濾過除菌,-20℃凍存。
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